Unser primäres Forschungsziel ist die Untersuchung einer möglichen Verwendung des Monoterpens Limonen und seiner Metabolite, wie Perillaalkohol u.a., in der Krebstherapie.
Tumorzellen - Selbstvernichtung durch ein Protein:
Seit einigen Jahren weiß man, daß Limonen - ein Extrakt, der unter anderem aus Orangenschalen gewonnen wird, das Wachstum von Tumoren stoppen und sie sogar schrumpfen lassen kann. Auf welche Weise das flüssige, duftende Elexier aus Kohlenwasserstoff die Krebszellen angreift, wurde dagegen erst kürzlich entdeckt. Wissenschaftler von der Duke University in North Carolina fanden heraus, dass das Protein TGF-b über einen komplizierten biochemischen Prozess bei den Tumorzellen ein Selbstmordprogramm auslöst. Normalerweise verhält sich das Protein im Körper passiv; das ändert sich nach Gaben von Limonen. Der Extrakt bewirkt, das sich TGF-b, aber auch dazu passende Rezeptorproteine auf den Tumorzellen explosionsartig vermehren. Erst wenn genug Rezeptoren vorhanden sind, an die sich TGF-b heften kann, kommt es zur Selbstvernichtung der Krebszellen. Gesunde Körperzellen wurden bei Laborversuchen nicht attackiert.
Eine Behandlung krebskranker Ratten mit Limonen hatte Erfolg: Bei 70 Prozent der Tiere verschwanden die Tumoren, bei 20 Prozent schrumpften die Krebsherde um mehr als die Hälfte. Da Limonen eine natürliche, ungiftige Substanz ist, verspricht man sich eine besonders schonende Therapie. Ob zu Recht, muss die jetzt in Großbritannien angelaufene klinische Testphase zeigen.
Barbara Kirchberger in der Wissenschaftszeitschrift „Kosmos“, März (1994)
D-Limonen und Perillaalkohol besitzen große chemotherapeutische Aktivität gegen Pankreas- (einer der hartnäckigsten und widerstandsfähigsten Krebsformen gegenüber allen verfügbaren Tumortherapien), Mamma- und Prostatatumoren.
Zusätzlich besitzen Perillaalkohol, Limonen und andere Monoterpene chemopräventive Aktivität und könnten so gegen neue Metastasenbildung erfolgreich eingesetzt werden.
Verschiedene Mechanismen zeichnen sich für den Anti-Tumor-Effekt der Monoterpene verantwortlich. Zum Beispiel inhibieren viele Monoterpene die post-translationale Isoprenylierung von Zellwachstums-Regulations-Proteinen wie Ras. Perillaalkohol induziert Apoptose, ohne die DNA-Synthese-Rate sowohl in Leber- als auch pankreatischen Tumorzellen zu beeinflussen.
Außerdem zeigten sich zurückbildende Mamma-Tumore von Ratten, die mit Monoterpenen behandelt wurden, eine erhöhte Bildung des TGF-b, begleitet von einer Tumordifferenzierung zu einem günstigeren Phänotypus.
Quellen von Limonen in der Ernährung und toxikologische Eigenschaften
In neuerer Zeit erschienen in der medizinischen Literatur interessante Artikel über das Monoterpen Limonen und dessen Verwendung als Cytostatikum (M.N.Gould; J.Cell.Biochem., Suppl.22; 139 (1995); P.L.Crowell, A.S.Ayoubi, Y.D.Burke in: Dietary Phytochemicals in Cancer Prevention and Treatment, Plenum Press, New York, 131 (1996)). Insbesondere beim Mammakarzinom (Brustkrebs), der häufigsten malignen Erkrankung der Frau, hat es hervorragende Ergebnisse im Tierversuch gezeigt. Dabei ist von besonderer Bedeutung, dass Limonen zum einen sehr einfach ohne großen technischen Aufwand in reinster Form und großen Mengen herzustellen ist, zum anderen im Gegensatz zu fast allen etablierten Cytostatika nicht toxisch ist.
Limonen ist besonders reichlich vorhanden in der Schale und auch dem Fruchtfleisch von Citrusfrüchten. Im Orangensaft beträgt die durchschnittliche Konzentration etwa 100 ppm. 1984 wurden etwa 254.000 kg dieses Stoffes in den USA verwendet, als Duftstoff in einer Reihe von Haushaltsreinigern, Seifen und Parfums, sowie als Geschmacksverbesserung für Lebensmittel, einschließlich Getränke, Backwaren und Wurstprodukten. Es wird außerdem in einer Vielzahl von Schmierstoffen und als industrielles Lösungsmittel als Ersatz für chlorierte Kohlenwasserstoffe eingesetzt.
Wegen seiner weitgestreuten Verwendung wurde eine toxikologische Studie vom U.S. National Toxikologie-Programm durchgeführt (Lit.: C.W.Jameson, Toxicology and carcinogenesis studies of d-limonen in F344/N Ratten und B6C3F1 Mäusen; NIH publication 90-2802 (1990)).
Die lethale Dosis beim Menschen beträgt ca. 0.5 bis 5.0 g Limonen pro Kilogramm Körpergewicht.
Der genetische Toxikologie-Test zeigte, daß Limonen nicht mutagen ist, weder im Ames-Test, noch im Mäuse-L 5178 Y Lymphom-Zell-Test mit oder ohne Aktivierung durch S9, und auch chromosomale Abweichungen oder Schwester-Chromatid-Austausche in Chinesischen Hamster-Eierstock-Zell-Kulturen (CHO) waren nicht zu beobachten.
Seit diese Berichte erschienen, wurde es möglich, höhere Dosen von d-Limonen an Nager über eine kurze Zeit zu verfüttern, vor allem, wenn man den Nagern eine gewisse Nachsicht entgegenbringt, bis sie sich an die Diät gewöhnt haben. Denn das Terpen ist für Ratten und Mäuse reizend; deshalb werden Nager die Diät anfänglich meiden, aber nach kurzer Zeit das Limonen zu sich zu nehmen, wenn es mit ihrem normalen Futter bzw. halb-synthetischer Diät vermischt wird.
Auch Perillaalkohol wurde toxikologisch und pharmakologisch untersucht (Lit: E.Evans, D.Arneson, R.Kovatch, J.Supko, T.Morton, L.Siemann, J.Cannon, J.Tomaszewski, A.Smith; Proc. Am. Assoc. Cancer Res.36; 366 (1995)) und seine prinzipielle Unbedenklichkeit festgestellt (Aufnahme in die FDA GRAS (generally regarded as safe)-Liste).
Limonen-Metabolismus: noch potentere Analoga?
Limonen wird in vivo sehr schnell metabolisiert. Japanische Forscher untersuchten erstmals die Metabolite von Limonen im Urin verschiedener Versuchstiere und fanden die Limonen-Derivate Uroterpenol, Carveol, Perillasäure und ihre Glycin- und Glucuronyl-Konjugate (Lit.: H.Igimi, M.Nishinura, R.Kodama, H.Ide; Xenobiotica 4, 77 (1974); R.Kodama, T.Yano, F.Furukawa, K.Noda, H.Ide; Xenobiotica 6, 377 (1976); J.W.Regan, M.M.Morris, B.Nao, L.F.Bjeldanes; Xenobiotica 10, 859 (1980); T.Watabe, A.Hiratsuka, N.Ozawa, M.Isobe; Xenobiotica 11, 333 (1981)). Allerdings werden Karzinome wohl eher von im Blut zirkulierenden Metaboliten bekämpft als von im Urin ausgeschiedenen. Deshalb untersuchte eine andere Forschergruppe die Plasma-Metabolite von Limonen in weiblichen Ratten und bestimmten ihre Auswirkungen auf das Zellwachstum. Die zwei circulierende Hauptmetabolite von Limonen waren Perillasäure und Dihydroperillasäure. Zwei Nebenprodukte wurden ebenfalls bestimmt und identifiziert als Methylester der zwei Säure-Hauptkomponenten (Lit.: P.L.Crowell, S.Lin, E.Vedejs, M.N.Gould; Cancer Chemother. Pharmacol.31; 205 (1992)).
Die Forscher zeigten auch, daß alle vier Metabolite des Limonens effektiver als Limonen in bezug einer Inhibierung der Protein-Isoprenylierung in Zellkulturen waren. Die rapide Metabolisierung von Limonen in Ratten einerseits wie die biologische Aktivität seiner Metabolite andererseits gaben zu der Vermutung Anlass, dass Limonen als Prodrug wirkt; insbesondere konnte die Antitumor-Aktivität von eben diesen Metaboliten herrühren. Deshalb war es wichtig, die Metabolite von Limonen im Menschen zu identifizieren und zu quantifizieren, um sie therapeutisch nutzen zu können.
Die Gruppe um Michael N.Gould führte eine Studie an gesunden Freiwilligen durch, um Plasma-Metabolite des Limonens zu identifizieren. Online-Kapillar-Chromatographie mit gekoppelter Massenspektrometrie (GC-MS)-Analysen zeigten, dass mindestens 5 Produkte nach 4 Stunden nachweisbar waren. Zwei Hauptpeaks wurden identifiziert als die Ratten-Limonen-Metabolite Dihydroperillasäure und Perillasäure. Zwei kleinere Peaks stellten sich als die jeweiligen Methylester dieser in der Ratte gefundenen Säuren heraus (dabei ist allerdings fraglich, ob diese tatsächlich in vivo entstanden sind oder über die Säuren in vitro während der GC-Analysen gebildet worden sind). Ein dritter Hauptpeak wurde als Limonen-1,2-diol identifiziert. Limonen wurde also im Menschen und der Ratte in gleicher Weise metabolisiert (Lit.: P.L.Crowell, Ch.E.Elson, H.H.Bailey, A.Elegbede, J.D.Haag, M.N.Gould; Cancer Chemother.Pharmacol.35, 31 (1994)).
Als erster Limonen-Metabolit wurde Perillaalkohol für eine in vivo-Ratten-Studie ausgewählt. Er ist, wie erwähnt, ein potenter Inhibitor der Protein-Prenylation in Zellkulturen, auf der FDA GRAS (generally regarded as safe)-Liste und kommerziell in hoher Reinheit (> 96 %) und Bulk-Mengen erhältlich.
Beim Test in der Therapie fortgeschrittener stabiler Ratten-Mamma-Karzinome, bewirkte 2-proz. diätetischer Perillaalkohol eine Rückbildung von 75 % dieser Tumoren (50 % total, 25 % partial), während um 7.5 - 10-proz. Limonen erforderlich wäre, um dieselbe Wirkung zu erreichen. Bei so geringen diätetischen Leveln um 0.5 % wurden noch signifikante Regressionsraten erreicht. So stellte sich Perillaalkohol als mehr als 5 mal potenter denn Limonen in diesem Modell-System heraus.
Es verminderte auch das Auftreten von Sekundärtumoren, was darauf schließen läßt, daß es ebenfalls chemopräventive Aktivität gegen Mamma-Karzinome haben könnte.
Interessanterweise sind die zirkulierenden Metabolite von Perillaalkohol identisch mit denen von Limonen, sind aber bei Tieren, die mit 2.5-proz. Perillaalkohol gefüttert wurden, in höherer Konzentration vorhanden als in Ratten, die mit 10-proz. Limonen gefüttert wurden.
In weiteren Tierversuchstests wurde ein chemotherapeutischer Effekt von Perillaalkohol auf Pankreas- und Prostatatumoren (Lit.: L.Jeffers, D.Church, M.Gould, G.Wilding; Proc.Am.Assoc.Cancer Res.36, 303 (1995)), sowie auf Dickdarmkrebs gefunden (Lit.: B.S.Reddy, C.-X.Wang, H.Samaha, R.Lubet, V.E.Steele, G.J.Kelloff; Cancer Res.57; 420 (1997)).
Wirkungsmechanismen
Der genaue Mechanismus, der der anticarcinogenen Aktivität von Limonen und seinen Derivaten zugrunde liegt, ist noch unbekannt. Es sind wohl verschiedene Mechanismen, die für die chemotherapeutische Aktivität der Monoterpene verantwortlich sind; es gibt keinen einheitlichen Wirkmechanismus, dieser differiert vielmehr von Tumor- zu Tumortyp.
Klinische Studien
Die hohe therapeutische Ratio der Monoterpene in der Therapie von Nagetier-Krebs hat zu klinischen Tests von Limonen und Perillaalkohol bei Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen geführt.
Einführende Phase I-Untersuchungen sind am Charing Cross Hospital London respektive der Universität Wisconsin abgeschlossen worden:
G.Ripple, M.N.Gould, J.Stewart, K.Tutsch, D.Alberti, C.Feierabend, K.Simon, R.Arzoomanian, M.Pomplun, G.Wilding und H.Bailey vom University of Wisconsin Comprehensive Cancer Center, Madison, WI 53792, führten eine Phase I Studie mit Perillaalkohol (POH) (NSC 641066), der auf TID-Basis (ter in die = dreimal täglich) gegeben wurde, durch. Sie behandelten 18 Patienten mit folgenden Dosen: Level (L)1: 800 mg/m2/dose; L2: 1600 mg; L3: 2400 mg. Die Hauptplasmalevel (mM) der zwei Hauptmetabolite an den Tagen 1 und 29 waren Perillasäure (PA), L1: 175 und 139, L2: 472 und 311, L3: 456 und 257; Dihydroperillasäure (DHPA), L1: 7.1 und 9.8, L2: 34.2 und 34.0, L3: 26.2 und 23.4. Die Peak level wurden 2-3 Stunden nach erfolgter Nahrungsaufnahme für Perillaalkohol und nach 3-5 Stunden für DHPA notiert. POH war im Plasma nicht nachweisbar. Die Metabolit-Halbwertszeiten schwankten für jeden einzelnen um die 2-3 Stunden. PA, DHPA und POH waren im Urin aller Patienten von L3 nachweisbar. Ungefähr 9 % der totalen Dosis war in den ersten 24 Stunden wiederzuentdecken. Die Hauptmenge wurde als PA wiedergefunden, weniger als 1 % als POH. Die Haupttoxizität, die beobachtbar war, war gastrointestinaler Art und setzte sich aus Eruktation, Unwohlsein, Völlegefühl und Anorexie zusammen. Zwei sich schon früher in schwerer Behandlung befindende Patienten erfuhren eine reversible ³ Grad 3-Granulozytopenie. Eine Grad 2-Ermattung konnte ebenfalls festgestellt werden.
Die klinischen Untersuchungen werden mit einem differenzierteren Dosis-Plan fortgeführt.
D.M.Vigushin, G.Poon, A.Boddy M.Jarman und R.C.Coombes vom Charing Cross Hospital, London W6 8RF UK, Institute of Cancer Research, Sutton SM2 5NG UK, University of Newcastle, Newcastle upon Tyne NE2 4HH, UK, untersuchten Limonen: In einer Phase I Studie wurde 42 Patienten mit refraktären soliden Tumoren 106 Einheiten von D-Limonen in täglichen oralen Dosen von 0.5 - 12 mg/m2/Tag in 21-Tages-Cyclen verabreicht. Die maximale tolerierte Dosis betrug 10 g/m2/Tag. Übelkeit, Erbrechen und Diarrhoe waren die dosislimitierenden Faktoren. Es wurde ein partielles Ansprechen bei einem Brustkrebspatienten mit 8 g/m2/Tag über 13 Monate und bei drei Patienten mit kolorektalem Krebs mit über einen längeren Zeitraum stabilen Krankheiten beobachtet.
Plasmapharmakokinetik-Analysen mittels LC-MS in 10 Patienten mit 8-12 g/m2/Tag-Dosierungen identifizierten D-Limonen (Cmax 10.8 ± 6.7 - 20.5 ± 11.2 mM; t1/2 34 ± 44 h), Perillasäure (Cmax 20.7 ± 13.2 - 71 ± 29.3 mM; t1/2 12 ± 2 h), Dihydroperillasäure (Cmax 16.6 ± 7.9 - 28.1 ± 3.1 mM; t1/2 16 ± 9 h), Limonen-1,2-diol (Cmax 10.1 ± 8 - 20.7 ± 8.6 mM; t1/2 9 ± 2 h), Uroterpenol (Cmax 14.3 ± 1.5 - 45.1 ± 1.8 mM; t1/2 35 ± 9 h) und ein neues Isomer der Perillasäure (vermutliche Identität: p-Mentha-1.8-dien-10-carbonsäure). LC-MS und 1H-NMR der Konjugate und Hydrolysate im Urin identifizierten Glucuronide der Perillasäure (beide Isomere), Dihydroperillasäure, Uroterpenol und ein Monohydroxylimonen.
Desweiteren sind vier weitere Phase I Studien in verschiedenen großen Krebszentren in den U.S.A. gestartet worden und, basierend auf den ermutigenden Phase I-Ergebnissen, plant die Gruppe um M.N.Gould in Wisconsin eine Phase II Untersuchung bezüglich Brust-, Eierstock- und Prostatakarzinomen Ende 1997 (M.N.Gould; Briefliche Mitteilung vom 8.4.97).
Fazit
Limonen bzw. seine Monoterpen-Metabolite besitzen eine beträchtliche Antitumoraktivität, orale Bioverfügbarkeit, geringe Toxizität und neue, ungewöhnliche Aktionsmechanismen, die sich von allen konventionellen Krebs-Chemotherapie-Agentien unterscheiden.
Diese Eigenschaften, zusammen mit den Ergebnissen der bereits abgeschlossenen klinischen Studien scheinen uns Anlass genug zu sein, uns weiter eingehend mit der Monoterpen-Therapie in der Krebsbehandlung zu befassen.
Neuere Berichte wie die von Prof.Dr.H.Schmandke (D-Limonen in Zitrusfrüchten mit antikanzerogener Wirkung, Ernährungs-Umschau 50 (2003) Heft 7 265) oder von Sebastian Jäger und Armin Scheffler, Niefern-Öschelbronn, und Herbert Schmellenkamp, Blaustein (Pharmakologie ausgewählter Terpene, http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=1354) zeigen noch immer nur die altbekannten Ergebnisse. Man kann sich des Eindrucks schwer erwehren, dass es kein rechtes Fortkommen mit dieser Monoterpen-therapie gibt, obwohl alle Ergebnisse sehr vielversprechend sind. Dass große Pharmafirmen sich dieses Produktes aufgrund einer mangelnden Patentierbarkeit nicht annehmen und so klinischen Studien nicht forciert werden, kann sicherlich mit ein Grund sein.
Cancer chemoprevention and therapy by monoterpenes. Gould, M.N. Environ. Health Perspect. (1997
Activation of the transforming growth factor beta signaling pathway and induction of cytostasis and apoptosis in mammary carcinomas treated with the anticancer agent perillyl alcohol. Ariazi, E.A., Satomi, Y., Ellis, M.J., Haag, J.D., Shi, W., Sattler, C.A., Gould, M.N. Cancer Res. 1999
Induction of cytostasis in mammary carcinoma cells treated with the anticancer agent perillyl alcohol. Shi, W., Gould, M.N. Carcinogenesis (2002) Perillyl alcohol mediated radiosensitization via augmentation of the Fas pathway in prostate cancer cells. Rajesh, D., Howard, S.P. Prostate (2003)
Perillyl alcohol induces c-Myc-dependent apoptosis in Bcr/Abl-transformed leukemia cells. Clark, S.S. Oncology (2006)
http://www.wikigenes.org/e/chem/e/369312.html
D-Limonen ist in zahlreichen Nahrungsmitteln enthalten, vor allem Zitrusfrüchten. Reines D-Limonen wird bislang nur von sehr wenigen ausländischen Herstellern als Nahrungsergänzungsmittel angeboten. Adressen und weitere Daten zu Limonen sind bei uns erhältlich.
